Ditiotreitol (DTT) je često korišten redukcijski agens, poznat i kao novi zeleni aditiv.To je organski spoj male molekule s dvije merkaptanske skupine (-SH).Zbog svojih redukcijskih svojstava i stabilnosti, DTT se široko koristi u eksperimentima biokemije i molekularne biologije.
Glavna uloga DTT-a je smanjiti disulfidne veze u proteinima i drugim biomolekulama.Disulfidna veza je važan dio savijanja i stabilnosti proteina, ali pod određenim eksperimentalnim uvjetima, kao što je reducibilna SDS-PAGE analiza, rekombinacija i savijanje proteina, potrebno je reducirati disulfidnu vezu na dvije tiolne skupine kako bi se razotkrila prostorna struktura protein.DTT može reagirati s disulfidnim vezama kako bi ih reducirao u merkaptanske skupine, otvarajući tako prostornu strukturu proteina i čineći ga lakim za analizu i manipulaciju.
DTT se također može koristiti za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima.U nekim reakcijama kataliziranim enzimima, aktivnost enzima može biti smanjena oksidansom.DTT može reagirati s oksidansima kako bi ih reducirao u bezopasne tvari, štiteći tako aktivnost i stabilnost enzima.
U usporedbi s tradicionalnim redukcijskim sredstvima kao što je β-merkaptoetanol (β-ME), DTT se smatra sigurnijim i stabilnijim redukcijskim sredstvom.Ne samo da je stabilan u vodenoj otopini, već također održava svoja redukcijska svojstva pri visokoj temperaturi i kiselo-baznim uvjetima.
Korištenje DTT-a je relativno jednostavno.Općenito, DTT se otapa u odgovarajućem puferu i zatim dodaje u eksperimentalni sustav.Optimalna koncentracija DTT-a treba se odrediti prema specifičnom eksperimentu, a općenito se koristi u rasponu od 0,1-1 mM.Niže koncentracije mogu smanjiti štetne učinke na rast stanica i mogu smanjiti citotoksičnost zbog prekomjerne ekspresije ciljnih proteina.Više koncentracije mogu uzrokovati prekomjerno metaboličko opterećenje stanice, utječući na rast stanice i učinkovitost ekspresije.
Način određivanja optimalne koncentracije može biti procjena razine ekspresije ciljnog proteina provođenjem IPTG indukcijskih testova pri različitim koncentracijama.Testovi male kulture mogu se izvesti pomoću raspona koncentracija IPTG (npr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM itd.), a učinak ekspresije pri različitim koncentracijama može se procijeniti otkrivanjem razine ekspresije ciljnog proteina (npr. Western blot ili fluorescentna detekcija).Prema eksperimentalnim rezultatima, kao optimalna odabrana je koncentracija s najboljim učinkom ekspresije.
Osim toga, također se možete pozvati na relevantnu literaturu ili iskustvo drugih laboratorija kako biste razumjeli uobičajeno korišteni raspon koncentracije IPTG u sličnim eksperimentalnim uvjetima, a zatim optimizirali i prilagodili prema eksperimentalnim potrebama.
Važno je napomenuti da optimalna koncentracija može varirati ovisno o različitim sustavima ekspresije, ciljnim proteinima i eksperimentalnim uvjetima, tako da je najbolje optimizirati od slučaja do slučaja.
Ukratko, DTT je često korišteno redukcijsko sredstvo koje se može koristiti za smanjenje disulfidnih veza u proteinima i drugim biomolekulama te za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima.Naširoko se koristi u eksperimentima iz biokemije i molekularne biologije.
Vrijeme objave: 28. rujna 2023