Ditiotreitol (DTT) je često korišteno redukcijsko sredstvo, također poznato kao novi zeleni aditiv. To je organski spoj male molekularne mase s dvije merkaptanske skupine (-SH). Zbog svojih redukcijskih svojstava i stabilnosti, DTT se široko koristi u biokemijskim i molekularno-biološkim eksperimentima.
Glavna uloga DTT-a je smanjenje disulfidnih veza u proteinima i drugim biomolekulama. Disulfidna veza važan je dio savijanja i stabilnosti proteina, ali pod određenim eksperimentalnim uvjetima, kao što su reducibilna SDS-PAGE analiza, rekombinacija i savijanje proteina, potrebno je reducirati disulfidnu vezu na dvije tiolne skupine kako bi se razotkrila prostorna struktura proteina. DTT može reagirati s disulfidnim vezama kako bi ih reducirao na merkaptanske skupine, čime se otvara prostorna struktura proteina i olakšava njegova analiza i manipulacija.
DTT se također može koristiti za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima. U nekim reakcijama kataliziranim enzimima, aktivnost enzima može biti smanjena oksidansom. DTT može reagirati s oksidansima kako bi ih reducirao na bezopasne tvari, čime se štiti aktivnost i stabilnost enzima.
U usporedbi s tradicionalnim redukcijskim sredstvima poput β-merkaptoetanola (β-ME), DTT se smatra sigurnijim i stabilnijim redukcijskim sredstvom. Nije samo stabilan u vodenoj otopini, već zadržava svoja redukcijska svojstva i pri visokim temperaturama i kiselo-baznim uvjetima.
Upotreba DTT-a je relativno jednostavna. Općenito, DTT se otapa u odgovarajućem puferu, a zatim dodaje u eksperimentalni sustav. Optimalnu koncentraciju DTT-a potrebno je odrediti prema specifičnom eksperimentu i općenito se koristi u rasponu od 0,1-1 mM. Niže koncentracije mogu smanjiti štetne učinke na rast stanica i mogu smanjiti citotoksičnost zbog prekomjerne ekspresije ciljnih proteina. Veće koncentracije mogu uzrokovati prekomjerno metaboličko opterećenje stanica, što utječe na rast stanica i učinkovitost ekspresije.
Optimalna koncentracija se može odrediti procjenom razine ekspresije ciljnog proteina provođenjem IPTG indukcijskih testova pri različitim koncentracijama. Testovi kulture malog opsega mogu se provesti korištenjem raspona IPTG koncentracija (npr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM itd.), a učinak ekspresije pri različitim koncentracijama može se procijeniti detekcijom razine ekspresije ciljnog proteina (npr. Western blot ili detekcija fluorescencije). Prema eksperimentalnim rezultatima, koncentracija s najboljim učinkom ekspresije odabrana je kao optimalna koncentracija.
Osim toga, možete se pozvati i na relevantnu literaturu ili iskustva drugih laboratorija kako biste razumjeli uobičajeno korišteni raspon koncentracija IPTG-a u sličnim eksperimentalnim uvjetima, a zatim ga optimizirali i prilagodili prema eksperimentalnim potrebama.
Važno je napomenuti da optimalna koncentracija može varirati ovisno o različitim ekspresijskim sustavima, ciljnim proteinima i eksperimentalnim uvjetima, stoga je najbolje optimizirati od slučaja do slučaja.
Ukratko, DTT je često korišteno redukcijsko sredstvo koje se može koristiti za smanjenje disulfidnih veza u proteinima i drugim biomolekulama te za zaštitu aktivnosti i stabilnosti enzima. Široko se koristi u biokemijskim i molekularno-biološkim eksperimentima.
Vrijeme objave: 28. rujna 2023.