Mnogo je neopjevanih heroja oko nas, koji se čine običnima, a zapravo nam šutke puno pridonose.Proteinaza K je "neopjevani heroj" u industriji molekularne dijagnostike, iako je u usporedbi s "velikim i moćnim" u industriji, proteinaza K toliko skromna da smo dugo zanemarivali njenu važnost.S izbijanjem nove korona epidemije, potražnja za proteinazom K je naglo porasla, a ponuda u zemlji i inozemstvu daleko zaostaje za potrošnjom, i svi su odjednom shvatili da je proteinaza K toliko važna.
Čemu služi proteinaza K?
Proteinaza K je serinska proteaza s aktivnošću proteolitičkog enzima i može održavati aktivnost u širokom rasponu okruženja (pH (4-12,5), pufer s visokim udjelom soli, visoka temperatura od 70°C, itd.).Osim toga, aktivnost proteinaze K ne inhibiraju SDS, urea, EDTA, gvanidin hidroklorid, gvanidin izotiocijanat itd., a određena količina deterdženta također može pojačati aktivnost proteinaze K. U medicinskom liječenju (dezinfekcija virusa i mikroba ), hrana (omekšavanje mesa), koža (omekšavanje dlake), vinarstvo (bistrenje alkoholom), priprema aminokiselina (degradirano perje), ekstrakcija nukleinske kiseline, in situ hibridizacija, itd., proteinaza K Postoje primjene.Najčešće korištena primjena je ekstrakcija nukleinske kiseline.
Proteinaza K može enzimolizirati sve vrste proteina u uzorku, uključujući one histone koji su čvrsto vezani na nukleinske kiseline, tako da se nukleinske kiseline mogu osloboditi iz uzorka i otpustiti u ekstrakt, olakšavajući sljedeći korak ekstrakcije i pročišćavanja.U detekciji virusne nukleinske kiseline, proteinaza K je jedna od važnih komponenti u otopini za uzorkovanje virusa.Proteinaza K može razbiti i inaktivirati protein ovojnice virusa, što je sigurnije tijekom faze transporta i detekcije;osim toga, proteinaza K također može razgraditi RNaza sprječava razgradnju virusne RNA i olakšava detekciju nukleinske kiseline.
Slava proteinaze K preko noći
Bilo u području znanstvenog istraživanja ili u području IVD-a, ekstrakcija nukleinske kiseline je najosnovniji eksperiment, tako da je proteinaza K uvijek bila vrlo važna pojava.Međutim, u prošlosti je proteinaza K bila daleko manje poznata od svoje uloge.Velikim dijelom to je zato što je odnos ponude i potražnje proteinaze K bio vrlo stabilan.Malo bi ljudi pomislilo da bi opskrba proteinazom K predstavljala problem.
S izbijanjem nove korona epidemije, potražnja za testiranjem nukleinske kiseline je porasla.Do kraja lipnja 2020. Kina je izvršila gotovo 90 milijuna novih testova krunice, a taj je broj još alarmantniji na globalnoj razini.U eksperimentima ekstrakcije nukleinske kiseline, radna koncentracija proteinaze K je oko 50-200 μg/mL.Općenito, potrebno je oko 100 µg proteinaze K za izdvajanje uzorka nukleinske kiseline.U stvarnoj upotrebi, kako bi se povećala učinkovitost ekstrakcije nukleinske kiseline, često će se proteinaza K koristiti u povećanoj količini.Otkrivanje nukleinske kiseline novog koronavirusa donijelo je veliku potražnju za proteinazom K.Izvorna ravnoteža ponude i potražnje proteinaze K brzo je prekinuta, a proteinaza K je preko noći postala važan materijal za prevenciju epidemije.
Poteškoće u proizvodnji proteinaze K
Iako su s razvojem epidemije ljudi počeli cijeniti važnu vrijednost proteinaze K, neugodno je da je zbog pretjerane niske razine proteinaze K nekoliko domaćih tvrtki uključeno u proizvodnju proteinaze K. Kada ljudi žele uspostaviti proizvodnju proteinaze K Tijekom procesa proizvodnje otkriveno je da je proteinaza K izuzetno poseban protein.Proširiti proizvodni kapacitet proteinaze K u kratkom vremenskom razdoblju iznimno je izazovno.
Velika proizvodnja proteinaze K suočava se sa sljedećim poteškoćama
1. Nizak izraz
Proteinaza K može nespecifično razgraditi većinu proteina i izazvati ozbiljnu toksičnost ekspresijske stanice domaćina.Stoga je razina ekspresije proteinaze K općenito vrlo niska.Probir ekspresijskih sustava i sojeva koji visoko eksprimiraju proteinazu K općenito zahtijeva dulji ciklus.
2. Ostaci pigmenata i nukleinskih kiselina
Fermentacija velikih razmjera unosi veliku količinu ostataka pigmenta i nukleinske kiseline domaćina.Te je nečistoće teško ukloniti jednostavnim postupkom pročišćavanja, a složeno pročišćavanje povećava troškove i smanjuje stopu oporabe.
3. Nestabilnost
Proteinaza K nije dovoljno stabilna, može se sama enzimolizirati i teško ju je stabilno čuvati na 37°C dulje vrijeme bez zaštitnog sredstva.
4. Lako se taloži
Prilikom pripreme liofiliziranog praha proteinaze K, kako bi se osiguralo da čvrsti sadržaj proteinaze K u liofiliziranom prahu bude velik, potrebno je dodati liofilizirano zaštitno sredstvo u visokoj koncentraciji, ali kada koncentracija proteinaze K dosegne 20 mg/ml i više, lako je. Agregacija tvori talog, što donosi velike poteškoće pri sušenju smrzavanjem proteinaze K s visokim sadržajem krutine.
5. Velika ulaganja
Proteinaza K ima snažnu aktivnost proteaze i može hidrolizirati druge proteaze u laboratoriju.Stoga proteinaza K zahtijeva specijalizirane proizvodne prostore, opremu i osoblje za istraživanje, razvoj i proizvodnju.
XD BIOCHEM-ova otopina proteinaze K
XD BIOCHEM ima zrelu platformu za ekspresiju i pročišćavanje proteina, te ima bogato iskustvo u ekspresiji i pročišćavanju rekombinantnih proteina i optimizaciji proizvodnih procesa.Brzim formiranjem tima za istraživanje i razvoj, proces proizvodnje proteinaze K velikih razmjera je prevladan.Mjesečna proizvodnja liofiliziranog praha veća je od 30 kg.Proizvod ima stabilne performanse, visoku enzimsku specifičnu aktivnost i nema ostataka citokroma i nukleinske kiseline domaćina.Dobrodošli da kontaktirate XD BIOCHEM Dobijte probni paket (E-mail:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
XD BIOCHEM tehnička rješenja uključuju
Integracijom plazmida s više kopija odabiru se sojevi visoke ekspresije s razinom ekspresije od 8 g/L, čime se prevladava problem niske razine ekspresije proteinaze K.
Uspostavom procesa pročišćavanja u više koraka, ostaci citokroma domaćina i nukleinske kiseline proteinaze K uspješno su uklonjeni ispod standardne vrijednosti.
Probirom formulacija zaštitnih pufera visoke propusnosti odabran je pufer koji može stabilno pohraniti proteinazu K na 37°C.
Puferi za probir prevladavaju problem da se proteinaza K lako agregira i taloži pri visokim koncentracijama i postavljaju temelje za sušenje zamrzavanjem proteinaze K s visokim udjelom krutine.
XD BIOCHEM uzorak proteinaze K
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene u aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene u aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi.
Usporedba učinka ekstrakcije nukleinske kiseline XD BIOCHEM proteinaze K i konkurentskih proizvoda.U procesu ekstrakcije nukleinske kiseline koristi se XD BIOCHEM odnosno kompetitivna proteinaza K.Učinkovitost ekstrakcije XD BIOCHEM proteinaze K je veća, a Ct vrijednost ciljnog gena niža.
Vrijeme objave: 31. prosinca 2021