Oko nas ima mnogo neopjevanih heroja, koji se čine običnima, ali zapravo nam tiho puno doprinose. Proteinaza K je "neopjevani heroj" u industriji molekularne dijagnostike, iako je u usporedbi s "velikim i moćnim" u industriji, proteinaza K toliko neupadljiva da smo dugo previdjeli njezinu važnost. S izbijanjem nove epidemije koronavirusa, potražnja za proteinazom K je naglo porasla, a ponuda u zemlji i inozemstvu znatno zaostaje za potrošnjom, te su svi odjednom shvatili koliko je proteinaza K važna.
Čemu služi proteinaza K?
Proteinaza K je serinska proteaza s proteolitičkom enzimskom aktivnošću i može održavati aktivnost u širokom rasponu okruženja (pH (4-12,5), pufer s visokim udjelom soli, visoka temperatura od 70°C itd.). Osim toga, aktivnost proteinaze K ne inhibiraju SDS, urea, EDTA, gvanidin hidroklorid, gvanidin izotiocijanat itd., a određena količina deterdženta također može pojačati aktivnost proteinaze K. Proteinaza K se koristi u medicinskom tretmanu (dezinfekcija virusa i mikroba), hrani (omekšavanje mesa), koži (omekšavanje kose), vinarstvu (bistrenje alkohola), pripremi aminokiselina (degradirano perje), ekstrakciji nukleinskih kiselina, in situ hibridizaciji itd. Postoje primjene proteinaze K. Najčešće korištena primjena je ekstrakcija nukleinskih kiselina.
Proteinaza K može enzimolizirati sve vrste proteina u uzorku, uključujući i one histone koji su čvrsto vezani za nukleinske kiseline, tako da se nukleinske kiseline mogu osloboditi iz uzorka i otpustiti u ekstrakt, olakšavajući sljedeći korak ekstrakcije i pročišćavanja. U detekciji virusne nukleinske kiseline, proteinaza K je jedna od važnih komponenti u otopini za uzorkovanje virusa. Proteinaza K može razgraditi i inaktivirati protein omotača virusa, što je sigurnije tijekom faze transporta i detekcije; osim toga, proteinaza K također može razgraditi RNazu koja sprječava razgradnju virusne RNK i olakšava detekciju nukleinske kiseline.
Preko noći slava proteinaze K
Bilo u području znanstvenih istraživanja ili u području IVD-a, ekstrakcija nukleinskih kiselina je najosnovniji eksperiment, pa je proteinaza K oduvijek bila vrlo važna. Međutim, u prošlosti je proteinaza K bila daleko manje poznata od svoje uloge. Veliki dio toga bio je zato što je odnos ponude i potražnje proteinaze K bio vrlo stabilan. Malo tko bi pomislio da bi opskrba proteinazom K mogla biti problem.
S izbijanjem nove epidemije koronavirusa, potražnja za testiranjem nukleinskih kiselina naglo je porasla. Krajem lipnja 2020. Kina je dovršila gotovo 90 milijuna novih testova koronavirusa, a taj je broj još alarmantniji na globalnoj razini. U eksperimentima ekstrakcije nukleinskih kiselina, radna koncentracija proteinaze K je oko 50-200 μg/mL. Općenito, potrebno je oko 100 μg proteinaze K za ekstrakciju uzorka nukleinske kiseline. U stvarnoj upotrebi, kako bi se povećala učinkovitost ekstrakcije nukleinske kiseline, proteinaza K se često koristi u povećanoj količini. Detekcija nukleinskih kiselina novog koronavirusa dovela je do velike potražnje za proteinazom K. Izvorna ravnoteža ponude i potražnje proteinaze K brzo je narušena, a proteinaza K preko noći je postala važan materijal za prevenciju epidemije.
Poteškoće u proizvodnji proteinaze K
Iako su s razvojem epidemije ljudi cijenili važnu vrijednost proteinaze K, neugodno je što se zbog pretjerano niske popularnosti proteinaze K, malo domaćih tvrtki bavilo proizvodnjom proteinaze K. Kada ljudi žele uspostaviti proizvodnju proteinaze K Tijekom proizvodnog procesa otkriveno je da je proteinaza K izuzetno poseban protein. Izuzetno je izazovno proširiti proizvodni kapacitet proteinaze K u kratkom vremenskom razdoblju.
Proizvodnja proteinaze K u velikim količinama suočava se sa sljedećim poteškoćama
1. Niska ekspresija
Proteinaza K može nespecifično razgraditi većinu proteina i uzrokovati ozbiljnu toksičnost za stanicu domaćina u kojoj dolazi do ekspresije. Stoga je razina ekspresije proteinaze K općenito vrlo niska. Probir ekspresijskih sustava i sojeva koji visoko eksprimiraju proteinazu K općenito zahtijeva dulji ciklus.
2. Ostaci pigmenata i nukleinskih kiselina
Fermentacija velikih razmjera uvodi veliku količinu pigmenta i ostataka nukleinskih kiselina domaćina. Teško je ukloniti te nečistoće jednostavnim postupkom pročišćavanja, a složeno pročišćavanje povećava troškove i smanjuje stopu oporavka.
3. Nestabilnost
Proteinaza K nije dovoljno stabilna, može se sama enzimizirati i teško ju je stabilno čuvati na 37°C dulje vrijeme bez zaštitnog sredstva.
4. Lako se taloži
Prilikom pripreme liofiliziranog praha proteinaze K, kako bi se osiguralo da je sadržaj krute tvari proteinaze K u liofiliziranom prahu visok, potrebno je dodati liofilizirano zaštitno sredstvo u visokoj koncentraciji, ali kada koncentracija proteinaze K dosegne 20 mg/mL i više, lako se stvara talog koji se agregira, što stvara velike poteškoće liofilizaciji proteinaze K s visokim sadržajem krute tvari.
5. Velika investicija
Proteinaza K ima snažnu proteaznu aktivnost i može hidrolizirati druge proteaze u laboratoriju. Stoga proteinaza K zahtijeva specijalizirane proizvodne prostore, opremu i osoblje za istraživanje, razvoj i proizvodnju.
XD BIOCHEM-ova otopina proteinaze K
XD BIOCHEM ima zrelu platformu za ekspresiju i pročišćavanje proteina te bogato iskustvo u ekspresiji i pročišćavanju rekombinantnih proteina i optimizaciji proizvodnih procesa. Brzim formiranjem istraživačko-razvojnog tima prevladan je proces proizvodnje proteinaze K velikih razmjera. Mjesečna proizvodnja liofiliziranog praha iznosi više od 30 kg. Proizvod ima stabilne performanse, visoku specifičnu aktivnost enzima i ne sadrži ostatke citokroma domaćina i nukleinskih kiselina. Dobrodošli u kontakt s XD BIOCHEM. Nabavite probni paket (e-pošta:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
Tehnička rješenja tvrtke XD BIOCHEM uključuju
Korištenjem integracije više kopija plazmida, odabrani su sojevi s visokom ekspresijom i razinom ekspresije od 8 g/L, što prevladava problem niske razine ekspresije proteinaze K.
Uspostavljanjem višestupanjskog postupka pročišćavanja, ostaci citokroma domaćina i nukleinske kiseline proteinaze K uspješno su uklonjeni ispod standardne vrijednosti.
Visokopropusnim probirom formulacija zaštitnih pufera odabran je pufer koji može stabilno pohraniti proteinazu K na 37°C.
Puferi za probir prevladavaju problem lakog agregiranja i taloženja proteinaze K pri visokim koncentracijama te postavljaju temelje za liofilizaciju proteinaze K s visokim udjelom krutih tvari.
Uzorak proteinaze K XD BIOCHEM
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: neće biti značajne promjene aktivnosti nakon 80 dana na sobnoj temperaturi.
Usporedba učinka ekstrakcije nukleinskih kiselina XD BIOCHEM proteinaze K i konkurentskih produkata. U procesu ekstrakcije nukleinskih kiselina koriste se XD BIOCHEM i konkurentna proteinaza K. Učinkovitost ekstrakcije XD BIOCHEM proteinaze K je veća, a Ct vrijednost ciljnog gena je niža.
Vrijeme objave: 31. prosinca 2021.