IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog β-galaktozidaznog supstrata, koji je visoko inducibilan. Pod indukcijom IPTG-a, induktor može formirati kompleks s represorskim proteinom, tako da se mijenja konformacija represorskog proteina, tako da se ne može kombinirati s ciljnim genom, a ciljni gen se učinkovito eksprimira. Dakle, kako treba odrediti koncentraciju IPTG-a tijekom eksperimenta? Je li što veća to bolja?
Prvo, shvatimo princip indukcije IPTG-a: laktoza operon (element) E. coli sadrži tri strukturna gena, Z, Y i A, koji kodiraju β-galaktozidazu, permeazu i acetiltransferazu. lacZ hidrolizira laktozu u glukozu i galaktozu ili u alo-laktozu; lacY omogućuje laktozi iz okoliša da prođe kroz staničnu membranu i uđe u stanicu; lacA prenosi acetilnu skupinu s acetil-CoA na β-galaktozid, što uključuje uklanjanje toksičnog učinka. Osim toga, postoji operativna sekvenca O, početna sekvenca P i regulatorni gen I. Kod gena I je represorski protein koji se može vezati na poziciju O operatorske sekvence, tako da se operon (meta) potisne i isključi. Postoji i mjesto vezanja za protein kataboličkog aktivatora gena - mjesto vezanja CAP uzvodno od inicijacijske sekvence P. Sekvenca P, sekvenca O i mjesto vezanja CAP zajedno čine regulatornu regiju lac operona. Kodirajući geni triju enzima regulirani su istom regulatornom regijom kako bi se postigla koordinirana ekspresija genskih produkata.
U odsutnosti laktoze, lac operon (meta) je u stanju represije. U tom trenutku, lac represor eksprimiran I sekvencom pod kontrolom PI promotorske sekvence veže se na O sekvencu, što sprječava vezanje RNA polimeraze na P sekvencu i inhibira inicijaciju transkripcije; kada je prisutna laktoza, lac operon (meta) može se inducirati. U ovom operonskom (meta) sustavu, pravi induktor nije sama laktoza. Laktoza ulazi u stanicu i katalizira se β-galaktozidazom kako bi se pretvorila u alolaktozu. Potonja, kao molekula induktora, veže se na represorski protein i mijenja konformaciju proteina, što dovodi do disocijacije represorskog proteina od O sekvence i transkripcije. Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima isti učinak kao i alolaktoza. Vrlo je snažan induktor koji bakterije ne metaboliziraju i vrlo je stabilan, pa se široko koristi u laboratorijima.
Kako odrediti optimalnu koncentraciju IPTG-a? Uzmimo za primjer E. coli.
Genetski modificirani soj E. coli BL21 koji sadrži pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT) inokuliran je u LB tekući medij koji sadrži 50μg·mL-1 Amp i uzgajan preko noći na 37°C. Gore navedena kultura inokulirana je u 10 bočica od 50 mL svježeg LB tekućeg medija koji sadrži 50μg·mL-1 Amp u omjeru 1:100 za ekspanzijsku kulturu, a kada je vrijednost OD600 bila 0,6~0,8, dodan je IPTG do konačne koncentracije. To je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Nakon indukcije na istoj temperaturi i u isto vrijeme, iz nje je uzet 1 mL bakterijske otopine, a bakterijske stanice su sakupljene centrifugiranjem i podvrgnute SDS-PAGE kako bi se analizirao utjecaj različitih koncentracija IPTG-a na ekspresiju proteina, a zatim odabrala koncentracija IPTG-a s najvećom ekspresijom proteina.
Nakon eksperimenata, utvrdit će se da koncentracija IPTG-a nije što veća. To je zato što IPTG ima određenu toksičnost za bakterije. Prekoračenje koncentracije također će ubiti stanicu; i općenito govoreći, nadamo se da što je više topljivog proteina eksprimirano u stanici, to bolje, ali u mnogim slučajevima kada je koncentracija IPTG-a previsoka, stvorit će se velika količina inkluzija. Tijelo, ali količina topljivog proteina se smanjuje. Stoga, najprikladnija koncentracija IPTG-a često nije što veća to bolja, već što je koncentracija niža.
Svrha indukcije i uzgoja genetski modificiranih sojeva je povećanje prinosa ciljnog proteina i smanjenje troškova. Na ekspresiju ciljnog gena ne utječu samo vlastiti faktori soja i ekspresijski plazmid, već i drugi vanjski uvjeti, poput koncentracije induktora, temperature indukcije i vremena indukcije. Stoga je općenito, prije nego što se nepoznati protein eksprimira i pročisti, najbolje proučiti vrijeme indukcije, temperaturu i koncentraciju IPTG-a kako bi se odabrali odgovarajući uvjeti i dobili najbolji eksperimentalni rezultati.
Vrijeme objave: 31. prosinca 2021.